免疫組織化學(xué) (Immunohistochemistry，IHC) 或免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry, ICC) 是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些多肽和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行原位定性、定位或定量研究的實驗技術(shù)。

 

標(biāo)本固定

 

       固定（Fixation）是使用化學(xué)試劑處理組織或細(xì)胞，的目的除了使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，減少或終止內(nèi)源性或外源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)，防止組織細(xì)胞自溶，更是為了保存組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原性，使抗原不失活，不發(fā)生彌散。較好的固定劑具有滲透性強(qiáng)；其次不能使組織發(fā)生過度收縮變形；還需使組織得到一定的硬度，有較好的折光度。

       固定劑多種多樣，例如無水酒精對糖原保存較好，容易使細(xì)胞收縮，其性能與95%酒精相似，很少單獨使用，一般只用于糖原的固定不同的抗原對固定液耐受程度不同。丙酮為易揮發(fā)的無色液體，有刺激性氣體?？墒沟鞍踪|(zhì)沉淀，滲透性強(qiáng)，細(xì)胞收縮嚴(yán)重，對核的固定差廣泛用于酶組織化學(xué)中的各種酶的固定，也有人用于抗原的保存，作為細(xì)胞涂片免疫組化的固定液。

       此外，有些固定劑對特殊組織有更好效果，如苦味酸對于頭皮、指甲固定有軟化效果，戊二醛（含有兩個醛基，具有很強(qiáng)的交聯(lián)作用）常用于電鏡標(biāo)本的固定，使用濃度為2.5%，PLP固定液（Periodate-lysine-paraformaldehyde，由過碘酸、賴氨酸和多聚甲醛混合組成的磷酸鹽緩沖液）對于含糖組織抗原保存更好。如上所述我們需要根據(jù)實際情況選擇合適的固定劑。

       目前常用的固定劑有中性甲醛液（甲醛飽和水溶液稱為福爾馬林），4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液。多聚甲醛固定效果溫和，廣泛應(yīng)用于免疫組織化學(xué)研究。甲醛能夠以固體的形式存在，即白色粉末狀的多聚甲醛。將多聚甲醛溶于PB，加熱至60℃（加熱可使多聚甲醛解聚為單體，必要時可滴加少量NaOH促進(jìn)其溶解），加熱攪拌至液體透明為止。

       固定方法多種多樣，常用的有浸透法、灌注法、原位法、滴片法、蒸汽法、微波法等，其中以浸透固定和灌注固定效果最好。灌注固定中將灌注針插入主動脈內(nèi)是灌注固定的關(guān)鍵，也是難點。首先準(zhǔn)確找到主動脈，這是此步驟的要點?？捎脺厣睇}水將胸腔內(nèi)的血液沖洗干凈，用眼科鑷子輕輕夾住心 外膜（夾的越少越好，以免影響取材）將心臟向左上方提起，即可看清主動脈，又可使灌注針很容易地插入主動脈內(nèi)。插入時動作要慢，針尖方向不要偏向右側(cè)，以免刺入右心房，如果感到有阻力，則將針退后、調(diào)整方向重新進(jìn)針，直到進(jìn)入主動脈，灌注針進(jìn)入主動脈后可在心臟的上方看到其位置，灌注針進(jìn)入主動脈的長度最好為3-5毫米。

 

脫水、石蠟包埋和制片

 

       脫水是指使用脫水劑置換組織中的水分使標(biāo)本內(nèi)處于無水狀態(tài)，具體是用梯度乙醇(由低到高)充分脫水，對于一些易脆的組織（如脾、肝臟等）應(yīng)減少高濃度酒精里的停留時間，透明的時間也應(yīng)該控制縮短。

對組織浸蠟時，一般選用56℃-58℃熔點的石蠟，石蠟液與標(biāo)本的比例應(yīng)該為（20-30）：1，浸蠟溫度最好不超過60℃，防止抗原的損失。

       包埋是指將已浸透石蠟的組織塊置入包埋模具內(nèi)，包埋應(yīng)選好角度動作迅速，以便切片時有完整的切面。切片時則要該快則快該慢則慢，及時檢查刀片是否出現(xiàn)缺口，最好使用新刀片以防止蠟帶出現(xiàn)劃痕。包埋后需要快速冷卻，使標(biāo)本與石蠟在短時間內(nèi)凝聚成密度一致的一個整體。

 

脫蠟和水化

 

      切片分別在二甲苯中10-15分鐘以脫掉組織中的石蠟，使組織恢復(fù)到固定后的正常狀態(tài)暴露出抗原以方便與一抗結(jié)合。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。脫蠟的效果主要是取決于切片的厚度、二甲苯的溫度、脫蠟時間，或移入恒溫箱加熱脫蠟。

       水化的目的是為了洗去溶解的石蠟和二甲苯。二甲苯屬于非水溶液的有機(jī)溶劑，進(jìn)入組織中的二甲苯不能與水溶性染色液相溶，需要通過梯度乙醇把組織中的二甲苯逐步替換出來，使標(biāo)本切片從無水狀態(tài)順利進(jìn)入染色液中進(jìn)行染色反應(yīng)。

 

抗原修復(fù)

 

       抗原修復(fù)是指暴露抗原被封閉或隱藏的表位，恢復(fù)其原有的空間狀態(tài)，提高抗原陽性檢出率的過程。由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。

       常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓加熱修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。其中高壓加熱修復(fù)這一方法簡便易操作，效果也更好。

        胰酶消化修復(fù)法主要用于細(xì)胞內(nèi)的抗原修復(fù)。使用0.1%氯化鈣（pH 7.6）制成0.05%-0.1%胰酶液，37℃孵育切片15-30分鐘，陳片應(yīng)當(dāng)適當(dāng)延長時間。

       使用高壓加熱修復(fù)對于修復(fù)溫度（92-98℃以上）和時間的把握十分重要，溫度越高修復(fù)時間越短，溫度與修復(fù)時間呈負(fù)相關(guān)。修復(fù)結(jié)束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復(fù)性。其次，盡量使用過量的抗原修復(fù)液，防止高溫液體揮發(fā)干涸，對切片造成不可逆的損傷。

 

滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素

 

       在傳統(tǒng)的親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）和鏈霉親和素-過氧化物酶法（SP法）中，免疫組化反應(yīng)容易受到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活和封閉。滅活內(nèi)源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫滅活約10分鐘左右，用甲醇配制過氧化氫更適合于保護(hù)抗原和固定組織。

 

血清封閉

 

     目的為了防止一抗與組織的非特異性結(jié)合，造成假陽性。

 

切片清洗

 

       PBS洗滌是為了去除未反應(yīng)的抗體和其他雜物，以減少非特異性反應(yīng)引起的背景著色和雜物污染，因此應(yīng)該充分洗滌，特別是一抗孵育后。一般使用PBS洗滌3次，每次5分鐘。

 

DAB顯色

 

       DAB顯色液（3,3’-二氨基聯(lián)苯胺）終產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色，為免疫組化最常見的的顯色液。DAB顯色的棕黃色色原穩(wěn)定性好，不溶于有機(jī)溶劑，可長期保存而不褪色。背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而背景著色較淺時即可沖洗。

       DAB顯色時間很短(如幾秒或幾十秒)就立即出現(xiàn)很深的棕褐色，這可能說明一抗?jié)舛冗^高，需要適當(dāng)下調(diào)抗體濃度；若很短時間就出現(xiàn)深背景，有可能非特異性蛋白封閉不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長(如超過10分鐘)才出現(xiàn)陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時間過長。貼片后梯度酒精脫水透明中性樹脂封片后拍片即可。

 

常見問題與解決方案

 

缺乏染色

 

下圖樣本是正常人肝血管組織，目標(biāo)蛋白是α-平滑機(jī)動蛋白，A圖是我們想得到的結(jié)果，B圖是做出來的實驗結(jié)果，與A圖相比，在紅圈處并沒有檢測到抗原。

 

高背景

 

下圖樣本是小鼠皮下移植瘤組織，目標(biāo)蛋白LYVE1，A圖是我們想得到的結(jié)果，B圖是做出來的實驗結(jié)果，與A圖相比，B圖背景高。

 

染色不正確

 

下圖樣本是人小腸粘膜組織，目標(biāo)蛋白IL-10，A圖是我們想得到的結(jié)果，B圖是做出來的實驗結(jié)果，在與A圖相同位置的B圖中沒有檢測到抗原，反而在組織邊緣檢測到組織表達(dá)。

 

 

整理自網(wǎng)絡(luò)