摘要：免疫組織化學(xué)用于研究組織中蛋白質(zhì)的定位。通過(guò)帶有顯色劑或熒光標(biāo)記的抗體對(duì)抗原的特異性結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)組織中蛋白質(zhì)的可視化，從而對(duì)組織和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性，定位，定量等分析。免疫組化通常分為一步法和兩步法。在一步法中，特異性抗體上直接帶有顯色劑或熒光基團(tuán)。在更廣泛使用的二步法中，被固定和通透化的組織首先與一抗混合。在一抗特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白后，加入帶有顯色劑或熒光基團(tuán)的二抗特異性結(jié)合一抗，使目標(biāo)蛋白可以在顯微鏡下被觀察到。
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本方案以果蠅卵巢為例，結(jié)合綠色熒光蛋白對(duì)兩種蛋白同時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色，用聚光掃描共聚焦顯微鏡同時(shí)進(jìn)行四通道掃描，從而達(dá)到對(duì)三種蛋白以及DNA在細(xì)胞中的分布進(jìn)行同步分析。
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材料與試劑
???? 1）培養(yǎng)皿
???? 2）載玻片
???? 3）蓋玻片
???? 4）雌性果蠅成蟲(chóng)
???? 5）Grace’s Insect Medium
???? 6）4%多聚甲醛 (paraformaldehyde, PFA)
???? 7）PBS (10×) (Beyotime, ST476)
???? 8）Triton X-100
???? 9）馬血清
???? 10）一抗 (特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白)
??????????? 兔抗c-Myc
??????????? 山羊抗CTP合成酶 (CTP synthase, CTPS)
???? 11）二抗 (帶有熒光基團(tuán)，特異性結(jié)合一抗)
??????????? Texas Red狗抗山羊IgG
??????????? Cy5狗抗兔IgG
???? 12）DNA熒光染料: Hoechst 33342
?? ? 13）凡士林
???? 14）指甲油
???? 15）磷酸緩沖液 (1× PBS) (見(jiàn)溶液配方)
???? 16）PST (1×) (見(jiàn)溶液配方)
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儀器設(shè)備
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???? 1) 鑷子
???? 2) 解剖顯微鏡 (OLYMPU SZ61)
???? 3) 移液器
???? 4) 激光掃描共聚焦熒光顯微鏡 (Leica SP5II或者SP8)
???? 5) 果蠅二氧化碳麻醉工作站
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實(shí)驗(yàn)步驟
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一、 組織解剖和固定
???? 1. 在飼養(yǎng)果蠅的容器中通入二氧化碳使果蠅麻醉，將果蠅倒出，置于表面通有二氧化碳的墊板上，挑選雌性果蠅。
???? 2. 在培養(yǎng)皿中倒入Grace’s Insect Medium，將果蠅置于液體中。用鑷子輕輕固定住果蠅腹部的前部，用另一把鑷子夾住果蠅腹部的倒數(shù)第二個(gè)體節(jié)，并將這部分從果蠅身體上扯下，卵巢會(huì)被一起扯出 (圖1)。盡快將卵巢轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，卵巢上附著的組織將會(huì)在后續(xù)步驟中被清除。
注：1)?解剖和固定在室溫下進(jìn)行，試劑應(yīng)在從冰箱拿出后放至室溫后再使用。2)?可使用移液器進(jìn)行轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移之前剪去移液管頂部的一部分使其能吸入卵巢大小的組織。如果組織容易粘在管壁上，可以先在新的培養(yǎng)皿中滴入一滴Grace’s Insect Medium，將鑷子夾在組織不易破損或者對(duì)于實(shí)驗(yàn)不重要的部分，輕輕夾起組織，置于新培養(yǎng)皿的液滴中，放下組織。
?????????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖1. 解剖果蠅卵巢示意圖.?
?????? A. 用鑷子輕輕固定住果蠅腹部的前部，用另一把鑷子夾住果蠅腹部的倒數(shù)第二個(gè)體節(jié)。B. 左手鑷子固定果蠅身體，右手鑷子將果蠅尾部?jī)蓚€(gè)體節(jié)輕輕拉出，卵巢會(huì)被一起扯出。這時(shí)不必對(duì)解剖組織進(jìn)行清理，迅速開(kāi)始解剖下一只果蠅。左撇子的拿鑷子解剖方式與此呈鏡像對(duì)稱。
???? 3. 使用移液器盡可能多的移去組織周圍的Grace’s Insect Medium。
???? 4. 使用移液器在組織上滴加200 μl 4% PFA，使組織浸沒(méi)在液滴中。在室溫下靜置固定10分鐘。
???? 5. 使用移液器盡可能多的移去卵巢周圍的PFA。
???? 6. 加入2 ml PBS，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，洗去殘留的PFA，移去PBS。一次即可。
???? 7. 加入PST，在解剖顯微鏡下去除卵巢周圍附著的其他組織。
???? 8. 將卵巢使用移液器轉(zhuǎn)移至600 μl離心管中，加入400 μl PST，儲(chǔ)存于4 °C或立即用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。
???? 注：根據(jù)組織和固定情況的不同，組織的有效的保存時(shí)間會(huì)有較大差異。為了取得最佳的染色效果，盡量使用新鮮制備的樣品。?
二、 免疫組化染色
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???? 1. 使用PST稀釋抗體原液，按比例配制20 μl體積的一抗溶液，使得一抗最終稀釋比例在1:200至1:1,000之間，或者是抗體終濃度為1 μg/ml。
????? 注：在本示例中一抗 (兔抗c-Myc，山羊抗CTPS) 的稀釋比例為1:200，一抗的濃度應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整。?
???? 2. 將兩對(duì)固定好的卵巢使用移液器轉(zhuǎn)移至新的600 μl離心管中。
注：卵巢屬于相對(duì)較大的組織，一般在20 μl的抗體溶液中加入2對(duì)卵巢。在抗體濃度相同的情況下，樣品越少染色效果越好。?
???? 3. 使用移液器盡可能多的移去卵巢周圍的液體。
???? 4. 加入20 μl一抗溶液。
???? 5. 室溫孵育過(guò)夜。
???? 注：一抗最佳孵育時(shí)間與溫度和樣品的情況有關(guān)，一般一抗孵育不超過(guò)一天。?
???? 6. 使用PST稀釋并配制二抗溶液，使得二抗最終稀釋比例在1:200至1:1,000之間。加入DNA染料 (DAPI或Hoechst，稀釋比例1:1,000)，總體積為20 μl。
注：本示例中二抗 (Texas Red狗抗山羊IgG; Cy5狗抗兔IgG)的稀釋比例為1:250，Hoechst 33342的終濃度為1 μg/ml。二抗和DNA染料的濃度應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整。?
???? 7. 使用移液器盡可能多的移去卵巢周圍的一抗溶液。
???? 8. 使用移液器加入200 μl PST，輕輕吹打，洗去殘留的一抗，移去PST。
注：如果樣品成像時(shí)背景信號(hào)較強(qiáng)，可多次重復(fù)這一步。?
???? 9. 加入20 μl二抗溶液。
???? 10. 室溫孵育過(guò)夜。
?????? 注：1)?二抗最佳孵育時(shí)間與溫度和樣品的情況有關(guān)，如果樣品成像時(shí)信號(hào)較弱，可以選擇延長(zhǎng)二抗孵育時(shí)間至兩天或更長(zhǎng)。2)如需儲(chǔ)存，可以在二抗孵育過(guò)夜后將樣品繼續(xù)放在二抗溶液中在4 °C保存。保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致較強(qiáng)的背景信號(hào)。?
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三、 制片與成像
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???? 1. 在紙巾上放置一片蓋玻片。
???? 2. 在蓋玻片的四角涂上凡士林
???? 3. 使用移液器將卵巢和15 μl左右的二抗溶液一起轉(zhuǎn)移至蓋玻片上。
????? 注：在二抗溶液濃度合理的情況下，不需要洗去二抗。?
???? 4. 將載玻片輕壓在蓋玻片上，使蓋玻片通過(guò)凡士林粘在載玻片上，翻轉(zhuǎn)載玻片，使蓋玻片在上，置于紙巾上。
???? 5. 使用移液管輕壓蓋玻片的四角，使四角的高度盡量相同，趕出載玻片和蓋玻片之間的氣泡。
???? 6. 如有液體溢出，輕輕用紙巾吸去。
???? 7. 使用指甲油密封蓋玻片的四邊。
???? 8. 待指甲油晾干后，可使用熒光顯微鏡或共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行成像。
?????? 注：在制片完成后應(yīng)盡快進(jìn)行成像。如果無(wú)法及時(shí)進(jìn)行成像，應(yīng)如免疫組化染色 (8) 中所述保存在二抗溶液中，在成像之前再取出制片。?
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結(jié)果與分析
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?????? 核苷酸CTP的從頭合成的限速反應(yīng)由CTPS催化。我們之前的工作表明，CTPS在果蠅卵巢里的細(xì)胞以及其他組織中可以形成蛇形的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，我們把這種結(jié)構(gòu)稱為細(xì)胞蛇 (英文單數(shù)是cytoophidium；復(fù)數(shù)是Cytoophidia) (Liu, 2010)。
? ? ? ?在尋找CTPS組裝成細(xì)胞蛇的因子研究中，我們發(fā)現(xiàn)原癌基因Myc表達(dá)量對(duì)細(xì)胞蛇的形成有影響。因此，我們利用果蠅遺傳手段，以果蠅卵巢中的單層上皮細(xì)胞濾泡細(xì)胞作為研究模型。細(xì)胞核中的GFP表明該細(xì)胞中Myc會(huì)因?yàn)镽NA干擾而表達(dá)水平降低。對(duì)此，我們?cè)诮馄使壂@得卵巢，并進(jìn)行固定之后，同時(shí)用兩種一抗 (兔抗c-Myc，山羊抗CTPS) 與樣品孵育，室溫過(guò)夜。
?????? 第二天把一抗用PST溶液清洗一遍。然后向裝有樣品的小管中同時(shí)加兩種二抗 (Texas Red狗抗山羊IgG; Cy5狗抗兔IgG)，并且加入DNA熒光染料Hoechst 33342，孵育，室溫過(guò)夜。次日可以制片用激光掃描共聚焦顯微鏡拍照。
? ? ? ?由于我們所用的四個(gè)不同染料 (Hoechst 33342，GFP，Texas Red和Cy5) 的激發(fā)光和收集光光譜均有不同，這樣我們可以在激光掃描顯微鏡下開(kāi)通四個(gè)通道，同時(shí)檢測(cè)DNA和三種蛋白質(zhì) (GFP，CTPS和Myc) (圖2)。這樣我們就可以清晰并且直接的觀察到，在Myc被敲低的細(xì)胞里 (GFP陽(yáng)性)，Myc的免疫染色幾乎沒(méi)有 (圖2D)。與之對(duì)比的是對(duì)照細(xì)胞 (GFP陰性) 里Myc免疫染色信號(hào)在細(xì)胞核里很明顯 (圖2D)。對(duì)應(yīng)的是，Myc蛋白水平高的細(xì)胞 (GFP陰性) 里CTPS可以形成纖維狀細(xì)胞蛇 (圖2C)，而Myc蛋白水平低的細(xì)胞 (GFP陽(yáng)性) 里則看不到CTPS組成的細(xì)胞蛇(圖2C)。這種多組分相互關(guān)系可以用不同色彩在疊加圖中展示 (圖2E)。因此，這個(gè)免疫組織化學(xué)的結(jié)果支持Myc對(duì)CTPS組裝成細(xì)胞蛇有調(diào)控作用 (Auguey等，2016)。
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溶液配方
????? 1) 磷酸緩沖液 (1× PBS)
????????? 使用去離子水稀釋PBS (10×) 至1×
????? 2) PST (1×)
????????? 1× PBS
????????? 0.3% Triton X-100
????????? 0.5%馬血清
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致謝
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劉冀瓏實(shí)驗(yàn)室的工作得到上?？萍即髮W(xué)，英國(guó)牛津大學(xué)以及英國(guó)醫(yī)學(xué)理事會(huì)的支持。本文實(shí)驗(yàn)方案改編自本實(shí)驗(yàn)室的發(fā)表文章Tastan和Liu (2015) 和Aughey等 (2016).
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參考文獻(xiàn)
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Copyright:???2019?The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：吳錚 , 劉冀瓏 . (2019). 果蠅組織免疫組織化學(xué). Bio-101: e1010256. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010256.
How to cite:?Wu, Z. and Liu, J. L. (2019). Immunohistochemistry of Drosophila?Tissues. Bio-101: e1010256. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010256.
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