免疫分析法是使用抗體檢測不同物質的實驗分析方法。它們通常用于生命科學行業(yè)的生物分析和生化實驗室。這些方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、酶免疫分析(EIA)、免疫印跡 (WB)、放射免疫分析(RIA)、蛋白質陣列、免疫組化(IHC)或免疫聚合酶鏈反應(Immuno-PCR)。在各種免疫分析法中，待測物的檢測都可能受到干擾的影響。如經(jīng)常發(fā)生的交叉反應、非特異性結合和基質效應。干擾物質在真實標本中以或多或少的顯著濃度水平存在，并與待測物或捕獲檢測抗體相互作用。通過使用一種新的緩沖液(Lowcross-Buffer)，替代傳統(tǒng)緩沖液，大多數(shù)干擾影響都可以避免。通過這種替換，提高了分析方法的質量和分析方法開發(fā)的效率。

尼爾斯·杰尼因其在免疫系統(tǒng)的構建和控制特異性方面的貢獻獲得1984年諾貝爾醫(yī)學獎，他在頒獎演講中提到，每一種抗體都是多特異性的。他將這一說法與免疫反應早期階段的抗體產(chǎn)生聯(lián)系起來。與目標分析物具有高親和力的抗體偶爾會顯示出令人驚訝的結果：在包被捕獲抗體的免疫檢測中，免疫印跡膜中不必要的條帶被染色，蛋白質陣列上得到錯誤斑點的熒光信號以及空白樣本的高背景信號。ELISA檢測中，得到陰性信號的高背景或假陰性結果。由于干擾效應造成的錯誤結果可能導致后續(xù)成本浪費和錯誤診斷。

所有的免疫分析方法的特征是在目標分析物和抗體之間的結合反應。這些方法存在的問題是經(jīng)常發(fā)生的干擾，導致了錯誤的檢測，這個問題至今未得到充分地解決。典型的干擾有非特異性結合，導致較差的信噪比和高背景， 交叉反應和基質效應。簡單地說，這些效應大多是基于分析物、捕獲抗體或檢測抗體與外部物質或表面的直接相互作用。圖1表示了一種典型干擾效應的簡化方案。在技術文獻中經(jīng)常被描述的已知的干擾因素有如異嗜性抗體和HAMAs（人抗小鼠抗體）、類風濕性因子、白蛋白、補體，溶菌酶以及其他等。

免疫分析標記帶來的干擾

在免疫分析中標記檢測抗體非常常見，譬如在競爭法中，標記待測分析物。經(jīng)常使用的標記有酶（堿性磷酸酶或（辣根）過氧化物酶）、熒光染料、放射性同位素或DNA(用于免疫PCR)。不必要的影響也出現(xiàn)在這里。危險在于，使用熒光染料作為標記，這類疏水染料會改變檢測抗體的結合能力，導致染料本身的非期望的結合，且降低了標記 蛋白的溶解度。此外，抗原與抗體的結合也會變?nèi)酢＠?，這些非特異性效應會導致抗體與表面(圖1A和B)、與樣品中的外部蛋白質(圖1C)或對捕獲抗體(圖1D)的結合增加。在這些情況下，會導致在沒有分析物存在時出現(xiàn)假陽性或整個檢測出現(xiàn)高背景。在蛋白質芯片上觀察到單個斑點的背景熒光增加，或信噪比完全變糟糕。同樣，血清樣本中的蛋白質或抗體也可以與熒光染料結合，減少甚至封閉染料的熒光。因此，一些研究人員已經(jīng)建議放棄熒光染料作為蛋白質陣列的標記或選擇其他標記。蛋白質芯片上的反應是非常復雜的，因為在一個反應體系中同時使用多種不同的捕獲抗體和標記的檢測抗體。因此，樣本中蛋白質或標記抗體與單點的非特異性結合的概率升高， 同時樣本中成分與抗體的結合帶來的干擾效應也隨之增加。

交叉反應帶來的干擾

交叉反應是指抗體也與目標分析物以外的其他結構結合的能力(圖1, I-K)。通常這些結構與被分析物有很大的相似性。因此，具有相似分子結構的代謝物或化學物質就是例子。氨基酸序列具有巧合相似性或同源性的蛋白質也會發(fā)生交叉反應。特別是在競爭法分析中，因為只是用了一種抗體，交叉反應發(fā)揮更大的作用。為了確認此類分析，對經(jīng)?？赡馨l(fā)生的交叉反應物質和交叉反應需要被量化。

交叉反應也可以在蛋白印跡檢測或免疫組化實驗中發(fā)揮重要作用。盡管人們不知道在每種情況下，這些不必要的結合的確切分子機制，交叉反應在其他條帶或細胞結構的染色中變得很明顯。在蛋白印跡檢測中，人們假設在許多情況下降解正確蛋白質的產(chǎn)物是自然的或合理的方式造成的。但在某些情況下，這并不是事實，我們需要考慮一抗或二抗的交叉反應。

圖1: 在免疫分析中可能出現(xiàn)的不同干擾效應的示意圖。

A: 標記的檢測抗體與未封閉的表面的非特異性結合。結果是假陽性信號。

B: 標記的檢測抗體與封閉表面的非特異性結合。盡管表面被封閉，但抗體與封閉蛋白相結合。結果是假陽性信號。

C: 干擾蛋白與檢測抗體的Fc片段結合，并在空間上阻礙待測物的結合。結果是假陰性信號。

D: 捕獲抗體與檢測抗體的Fc片段結合。結果是假陽性信號。待檢測物不能再與捕獲抗體結合。

E: 不受影響的試驗，沒有任何干擾。理想的狀態(tài)。

F: 通過異嗜性抗體或HAMAs進行的橋接結合。通過此方法，捕獲抗體與檢測抗體連接，從而產(chǎn)生假陽性信號。

G: 一種與捕獲抗體具有抗獨特型結合特性的HAMA。干擾抗體結合在捕獲抗體Fab片段的高度可變區(qū)域，從而阻止了待測物的結合。因此，就會出現(xiàn)假陰性信號。

H：一種與檢測抗體具有抗獨特型結合特性的HAMA。干擾抗體結合在檢測抗體Fab片段的高度可變區(qū)域，并阻止待測物的結合。結果，出現(xiàn)了假陰性信號。

I：干擾物質與捕獲抗體的交叉反應性。結果是假陰性信號。

J：干擾物質與檢測抗體的交叉反應性。結果是假陰性信號。

K：與捕獲抗體和與檢測抗體的交叉反應性。這種現(xiàn)象在實踐中很少出現(xiàn)，這種抗體的特異性肯定較低。這種干擾現(xiàn)象也可以發(fā)生在待測物具有蛋白質保守氨基酸序列，該序列也出現(xiàn)在其他蛋白質上。

L：樣本中的其他蛋白質掩蔽待測物，使其表位被封閉，無法與捕獲抗體結合，或空間位阻情況嚴重。結果是假陰性信號。

非特異性結合帶來的干擾

與交叉反應密切相關的是非特異性結合。然而，兩者在分子水平上的機理有所不同。在日常的實驗室工作中， 這些差異不明顯。交叉反應中，造成交叉反應的物質是已知的，并且它的交叉反應性可以定量，譬如與交叉反應物的濃度競爭關系。而在非特異性結合的情況下，結合涉及的物質， 遠遠超過目標分析物(如與白蛋白或免疫球蛋白的非特異性結合)或與表面(如ELISA孔或免疫印跡膜表面)或蛋白質芯片中的固定抗體斑點。

基質效應

基質效應是樣本中所含成分帶來的干擾效應的總和，影響目標分析物的檢測。如果產(chǎn)生干擾的真正分子原因還沒有確定，但人們知道它來自于樣本，那么一般就稱之為“基質效應”。從一種效應到另一種效應的邊界是不固定的，有時并不清晰。一些基質效應來自“抗動物抗體”，另一些來自異嗜性抗體，或來自內(nèi)源性干擾，或僅僅來自粘度、ph值或僅僅來自鹽濃度。

抗動物抗體產(chǎn)生的干擾

人抗動物抗體(HAAA)可為IgG-、IgA、IgM或IgE型。它們是免疫系統(tǒng)應答的一部分，與動物來源的免疫球蛋白結合。HAAAs在許多診斷性免疫分析中是眾所周知的干擾物，有時可能是80%的臨床標本的一部分——取決于具體應用研究。HAAAs的濃度最高可達每毫升數(shù)毫克。

人抗小鼠抗體(HAMA)是免疫分析中最常見的干擾抗體。HAMAs是人類抗體，具有顯著的特異性，有時具有明顯的小鼠抗體親和力?；颊唧w內(nèi)產(chǎn)生這些抗體的原因通常是使用治療性抗體藥物治療癌癥而產(chǎn)生。用藥后，患者的免疫系統(tǒng)會對這些外源性抗體產(chǎn)生反應，形成針對治療性小鼠抗體的自身抗體。因此，如果免疫分析中使用小鼠抗體作為分析試劑， HAMAs會干擾免疫檢測結果。在使用小鼠單克隆抗體的夾心法分析中，這可 以導致捕獲抗體和檢測抗體之間的直接結合，而無需任何分析物(圖1F)。這會導致假陽性信號。來自不同物種的抗體序列有相似之處。這意味著，含HAMAs的血清也可能會在使用來自其他物種的抗體的檢測中產(chǎn)生問題，并產(chǎn)生同樣的錯誤信號結果。

HAMAs不僅來源于抗體治療，長期接觸家畜和寵物，最終也會形成針對這些動物的抗體。有人在患者的血清中發(fā)現(xiàn)了針對兔子、老鼠、狗、倉鼠的抗體。這些抗動物抗體干擾了一些具有不同親和力和不同問題的檢測抗體。一些干擾抗體不僅針對檢測抗體的Fc片段，也針對檢測抗體的Fab片段。這可能導致正確結合減少或完全阻礙，從而導致假陰性信號(圖1G和H)。如果HAAAs與Fc片段結合，它們被稱為抗同型干擾。如果它們結合到高度可變的Fab片段上，它們就被稱為抗獨特型干擾。

異嗜性抗體帶來的干擾

泰伯醫(yī)學詞典將異嗜性抗體定義為“與特定抗原以外的其他抗原結合的抗體”。異型抗體可為IgG、IgA、IgM或IgE型。特別是IgM型在風濕病患者的血清中起著特殊的作用。這些血清中含有高濃度的所謂類風濕性因子。類風濕性因子是IgM抗體，可與人類抗體的Fc部分結合，因此也與實驗中使用的抗體的Fc部分結合，且與物種無關。因此，風濕病血清將捕獲與檢測抗體連接起來，導致假陽性結果。這同時也是異嗜性抗體的一般干擾機制。風濕病血清的效應類似于HAAAs的效應。與HAAAs相比的區(qū)別在于異嗜性抗體的來源，他們不是建立在與動物免疫球蛋白反應的基礎上，而是早期免疫應答的多特異性抗體或來源不明的干擾性抗體。

因HAAAs或異嗜性抗體造成的干擾被發(fā)現(xiàn)已有30多年。干擾抗體是來自動物源的一般弱結合抗體，主要干擾由于分析物濃度低，血清或血漿樣本需低稀釋度稀釋的分析。向樣本緩沖液中添加阻斷物——通常是非特異性血清、抗體片段或高濃度的動物免疫球蛋白——能夠通過競爭減少HAAAs或異嗜性抗體的干擾效應，但不能完全避免。

樣品內(nèi)源性物質帶來的干擾

即使是標本中天然存在的蛋白質也會干擾免疫分析。人血清中眾所周知的干擾物質有白蛋白、補體、溶菌酶和纖維蛋白原。低分子量的分析物可以與白蛋白結合，這使得抗體與分析物的結合變得困難。許多激素都與轉運蛋 白結合，這也可能為免疫分析帶來困難。此外，許多蛋白質具有結合其他物質和蛋白質的能力。這種結合能力通常是各自蛋白質生物學功能的重要組成部分。白蛋白、補體和C反應蛋白(CRP) 是多種物質的天然受體。因此，非特異性結合甚至交叉反應——如與抗體的反應一樣——都是可能發(fā)生的。這使得在免疫檢測中識別某些分析物變得復雜。內(nèi)源性 蛋白可以作為一種干擾因子與抗體結合(圖1C,I-K)或掩蔽目標分析物(圖1L)。例如，溶菌酶能非特異性地與具有低等電點的蛋白質結合。因此，低等電點（約5）的抗體可以與之結合，并在捕獲抗體和檢測抗體之間建立橋梁。需要提到的一個重要方面是，含有大量脂質的標本的干擾，因為一些分析物是脂溶性的，且抗體與分析物之間的結合可能也會受到脂質的影響。

鉤狀效應

鉤狀效會導致假陰性結果，但與其他干擾效應不同的是，它不是通過與干擾因素的相互作用而產(chǎn)生。

免疫分析時，當樣本與分析抗體直接混合，且分析物的濃度非常高時，鉤狀效應就有可能發(fā)生。在這種情況下，當分析物的高濃度超過分析抗體的濃度時， 捕獲抗體和檢測抗體會出現(xiàn)飽和。因此高濃度被判讀為遠低于實際的低濃度， 從而導致對真實濃度的顯著低估。在實踐中，通過使用更高濃度的檢測抗體或者稀釋樣本，可以避免鉤狀效應。或者，必須對實驗進行系統(tǒng)化稀釋，以確保檢測值不受鉤狀效應的影響。已知的可能受到鉤狀效應影響的臨床參數(shù)有： CRP、AFP、CA125、PSA、鐵蛋白、催乳素及TSH等。

使用LowCross Buffer®防止干擾

造成所描述的干擾效應的原因是相似的。干擾因子與抗體或分析物之間存在不必要的從低到中的親和作用。標記抗體與其他蛋白質或表面的低親和力結合或中親和力結合，同樣抗體與結構相關物質低到中親和交叉反應。LowCross Buffer®利用了這些干擾效應的共同之處：干擾反應弱于真實分析物的特異性結合。當然，很少有因發(fā)生非常高的親和的交叉反應，達到與真正特定性結合相同的結果。在這種情況下， 人們必須談論一個特定的結合，并且在原則上有一個針對兩種不同物質的抗體。因此，這種抗體根本不能用于特定的分析。Low Cross Buffer® 是專門開發(fā)來消除低和中親和力結合，但不會對高特異性的高親和力結合產(chǎn)生任何負面影響。

圖2到圖5顯示使用LowCross Buffer®可防止免疫分析中典型的干擾效應的不同示例。圖2顯示了在蛋白芯片應用中使用LowCross Buffer®可降低高背景，并將信噪比從3.4提高到17.3。在這個實驗中，對不同多克隆抗EPIL抗體(EPIL=早期胎盤胰島素樣生長因子) 的適用性進行了測試?？贵w使用濃度為500µg/ml、體積為1.8 nl/spot通過生物芯片打點機（GMS 417）固定在氨基硅烷化的微陣列載玻片上。隨后，將2ml的EPIL過度表達細胞系（SKBR3） 培養(yǎng)基與染料Oyster650P混合，此時培養(yǎng)基內(nèi)蛋白質被標記。分別使用LowCross Buffer®和PBS按照1：20稀釋培養(yǎng)基，加在載玻片上進行孵育。沖洗載玻片后，用熒光掃描儀（GMS 418） 進行讀取，并用ImaGene分析數(shù)據(jù)。通過使用LowCross Buffer®可以明顯降低背景信號，從而使得更好地區(qū)分單個抗體是否適用于檢測EPIL。

圖2: 減少檢測抗體與蛋白質芯片表面的非特異性結合。通過使用LowCross-Buffer®，將信噪比從3.4提高到17.3。(數(shù)據(jù)源自N. Dankbar, university of Münster)

圖3顯示用westen blotting法檢測來自肝細胞和HeLa細胞的角蛋白4、5 和6，其中通過交叉反應非特異性結合檢測到比正確條帶更多的條帶。蛋白質樣品在12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳跑樣，然后印跡到硝基纖維素膜上。蛋白質樣本中的細胞角蛋白的westen blotting檢測方法采用改進的標準流程。抗細胞角蛋白抗體用LowCross Buffer® 或 TTBS（Tween- Tris緩沖鹽水）按照1：2500比例稀釋，用堿性磷酸酶標記的二抗進行檢測（二抗用LowCross緩沖液®或TTBS 按照1：1250比例進行稀釋），再加入底物BCIP/NBT顯色。如果沒有LowCross Buffer®的幫助， 很難揭示非特異性結合反應的確切分子原因。由于其他細胞角蛋白及其裂解產(chǎn)物或與肝臟或HeLa細胞的細胞破裂產(chǎn)生的不同蛋白質的非特異性結合，可能導致交叉反應發(fā)生。用LowCross buffer®替換TTBS，稀釋一抗和二抗，可以將非必要的結合減少，細胞角蛋白只在56 -60kDa的正確分子量區(qū)域內(nèi)被染色。

圖3: Western blotting法檢測細胞角蛋白4、5和6。圖中顯示了實驗中使用LowCross Buffer®和TTBS檢測的效果對比。LowCross Buffer® 可以完全防止不必要的結合。細胞角蛋白4、5和6在56-60kDa之間，使用LowCross Buffer® 可清晰地被檢測到。泳道1和1'樣本來自肝細胞，泳道2和2'樣本來自Hela細胞。M為分子量marker，用酰胺黑染色。印跡膜是硝酸纖維素膜porablot NCP。

圖4 顯示了基質效應如何影響ELISA。通過這種模型分析（由Candor Bioscience公司開發(fā)），系統(tǒng)地誘導了基質效應。用兔血清作為基質，加入一定濃度的C反應蛋白。使用捕獲抗體(clone C2,1 µg/ml))和生物素化檢測抗體（clone C6, 2 µg/ml）。加入的血清樣品分別用PBS-BSA緩沖液或LowCross-Buffer®按照1：2進行稀釋，用ELISA檢測。通過加入辣根過氧化物酶結合物及TMB底物進行檢測。

圖4:ELISA法檢測家兔血清中的CRP。 LowCross-Buffer®通過去除基質效應來提高靈敏度。

基質效應的確切分子基質未知，它會導致校準曲線的靈敏度變差。CRP蛋白由于其生理特征，能夠結合許多蛋白質和其他物質，可能顯著降低表位的可用性。雖然不能排除圖1(I-L)中所示的干擾效應發(fā)生的可能，但大概率會發(fā)生圖1(L)所示的干擾效應。LowCross Buffer®可防止CRP與兔血清內(nèi)源性物質結合，從而將校準曲線的靈敏度提高3倍。

圖5是用于豚鼠免疫毒理學研究的抗豚鼠免疫球蛋白的ELISA示例。在本試驗中，特異性對照（A1-A12行）和空白值（H1-H12）的假陽性結合破壞了數(shù)據(jù)評估。LowCross Buffer®的使用防止了假陽性信號，而且使B至G行1-6或B至G行7-12的濃度檢測成為可能。使用山羊抗豚鼠IgG F（ab'）2作為捕獲抗體，并使用生物素化的山羊抗豚鼠IgG（Fcγ）作為檢測抗體。豚鼠IgG用LowCross Buffer®或PBS進行稀釋。PBS-BSA緩沖液用作封閉緩沖液。用鏈霉親和素過氧化物酶和鄰苯二胺進行檢測。

圖5: 在用豚鼠IgG進行ELISA實驗中，通過使用LowCross-Buffer®防止假陽性結合（A1- 12行為對照組，H1-12為空白組）。